【產品名稱】

商品名稱：豬瘟病毒（CSFV）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name ：Classical Swine Fever Virus Detection Kit （Real-Time PCR Method）

【包裝規格】50T/盒

【預期用途】 豬瘟是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）引起豬的以稽留高熱、皮膚和黏膜出現大量出血點為 主要特征的一種高度接觸性、致死性的傳染病[1]，主要通過呼吸道和消化道傳染，傳播速度快， 發病率和病死 率高，給養豬業帶來了巨大的經濟損失[2]，被世界動物衛生組織（OIE）列為必須報告的動物傳染病，被我 國農業部列為一類動物疫病，是危害我國養豬業最嚴重的動物疫病之一。 本試劑盒適用于檢測的扁桃體、淋巴結等組織病變部與健康部交界處組織、全血等標本中豬瘟病毒 RNA， 適用于豬瘟病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】 本試劑盒用一對豬瘟病毒特異性引物，結合一條特異性熒光探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術對豬瘟病毒 RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】 包裝規格 50T/盒 CSFV 反應液 500μL×2 管 酶液 50μL×1 管 CSFV 陽性質控品 50μL ×1 管 陰性質控品 250μL ×1 管 說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】 -20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次，有效期 12 個月。 【適用儀器】 ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】 病死或撲殺的豬，取扁桃體、淋巴結等組織病變部與健康部交界處組織；待檢活豬，用注射器取血 5mL。

【保存和運輸】 上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸， 嚴禁反復凍融。

【使用方法】 

1. 樣品處理（樣本處理區）

1.1 樣本前處理 每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生 理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離 心管中；全血樣品待血凝后取血清 100μL，置 1.5mL 離心管中。

1.1 核酸提取 推薦采用優利科（上海）生命科學有限公司生產的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請按照 試劑說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區） 根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N（N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管 數每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應體系配制如下表： 試劑 CSFV 反應液 酶液 用量 20μL 1μL 將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21μL/管。

3. 加樣（樣本處理區） 將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短 暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區） 4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內； 4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光， 選擇 None 即可。 4.3 推薦循環參數設置： 步驟 循環數 溫度 時間 收集熒光信號 1 1 cycle 42℃ 20min 否 2 1 cycle 95℃ 10min 否 3 40 cycles 94℃ 15sec 否 55℃ 30sec 是

5. 結果分析判定 5.1 結果分析條件設定 設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像 調節 Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范圍內調節）、stop 值（一般可在 5~20 范圍內調節），以及 Threshold 的 Value 值（上下拖動閾值線至高于陰性對照），重新分析結果。

5.2 結果判斷 陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數增長曲線； 可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 3538 或無 Ct 值。

6. 質控標準 陰性質控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示； 陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7. 檢測方法的局限性 1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關； 2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果； 3.陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果； 4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果； 5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果； 6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果； 7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】 1.所有操作嚴格按照說明書進行； 2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心； 3.反應液應避光保存； 4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊； 5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服； 6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染； 7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器； 8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】 [1] Moennig V, Floegel-Niesmann G, Greiser-Wilke I. Clinical signs and epidemiology of classical swine fever: review of new knowledge [J]. Vet J, 2003, 165（1）: 1-2. [2] Backer J A, Brouwer H, Schaik G, et al. Using mortality data for early detection of classical swine fever in the Netherlands [J]. Prev Vet Med, 2011, 99（1）: 38-47. [3] 國家質量監督檢驗檢疫總局. GB/T 27540-2011 鑒豬瘟病毒實時熒光 RT-PCR 檢測方法