豬藍耳病毒經典型/豬藍耳病毒NADC30株核酸檢測試劑盒雙重熒光PCR

更新時間：2022-04-21

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【產品名稱】

商品名：豬藍耳病毒經典型/豬藍耳病毒 NADC30 株(PRRSV-C/PRRSV-NADC30)核酸檢測試劑盒(雙重熒光PCR 法)

Name ： Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome classical type and NADC30 type Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規格】50T/盒

【預期用途】豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome, PRRS)，又稱藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起豬的高度接觸性傳染病，是影響世界養豬業健康發展的重要傳染病之一。本試劑盒適用于檢測豬扁桃體、腦組織、血液等標本中的豬藍耳病毒經典型和豬藍耳病毒 NADC30 株，適用于這 2 種病原感染的輔助診斷及流行病學調查。

【檢驗原理】本試劑盒分別根據豬藍耳病毒經典型和豬藍耳病毒 NADC30 株基因保守區設計特異性引物和探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術對這 2 種病毒 RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

包裝規格	50T/盒
PRRSV-C/-NADC30反應液	500μL×2 管
酶液	50μL×1 管
PRRSV-C/-NADC30 陽性質控品	50μL ×1 管
陰性質控品	250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】 -20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次，有效期 9 個月。

【適用儀器】 ABI 系列、安捷倫 MX3000P/3005P、Bio-Rad CFX96 等熒光定量 PCR 儀。

【標本采集】病死或撲殺豬，取扁桃體和腦組織；待檢活豬，用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。

【保存和運輸】上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】 1. 樣品處理（樣本處理區）

1.1 樣本前處理取組織樣品約 1g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中， 8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；血液樣品取血清 100μL 提取。

1.2 核酸提取推薦采用優利科（上海）生命科學有限公司生產的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請按照試劑說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區）根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N（N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應體系配制如下表：

試劑	PRRSV-C/-NADC30 反應液	酶液
用量	20μL	1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21μL/管。

3. 加樣（樣本處理區）將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM、CY5，淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光。

4.3 推薦循環參數設置：

步驟	循環數	溫度	時間	收集熒光信號
1	1cycle	42℃	20min	否
2	1 cycle	95℃	10min	否
3	40 cycle	94℃	15sec	否
		55℃	30sec	是

5. 結果分析判定

5.1 結果分析條件設定設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范圍內調節）、stop 值（一般可在 5~20 范圍內調節），以及 Threshold 的 Value 值（上下拖動閾值線至高于陰性對照），重新分析結果。

5.2 結果判斷 FAM 通道為豬藍耳病毒經典型檢測結果，CY5 通道為豬藍耳病毒 NADC30 株檢測結果陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數增長曲線；可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；陰性：樣本檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6. 質控標準陰性質控品：Ct 值>38 或無 Ct 值；陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32；以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7. 檢測方法的局限性 1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；

3.陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；

7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。