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產品簡介
轉基因大米Bt（cryAc）熒光PCR試劑盒適用于檢測氣管分泌物拭子、肺組織等樣本中的轉基因大米Bt（cryAc），用于轉基因大米Bt（cryAc）感染的輔助診斷，其檢測結果僅供參考。
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轉基因大米Bt（cryAc）熒光PCR試劑盒
【產品名稱】
通用名稱：轉基因大米Bt（cryAc）熒光PCR試劑盒
Name ：Transgenic Rice Bt (CryAc) Gene Detection Kit (Real-Time PCRMethod)
【包裝規格】50T/盒
【預期用途】
本試劑盒適用于檢測轉基因大米Bt（CryAc)基因，用于篩查待檢測植物中是否含有CryAc成分。其檢測結果僅供參考。
【檢驗原理】
本試劑盒用國家標準的CryAc特異性引物和探針，用熒光PCR 技術進行轉基因成分的檢測。
【試劑組成】
名 稱 | 規 格 |
酶液 | 50μL×1管 |
CryAc反應液 | 1.0mL×1管 |
CryAc陽性質控品 | 50μL ×1管 |
陰性質控品 | 250μL ×1管 |
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃避光保存、運輸、避免反復凍融，有效期12個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【標本采集】
稱取200g樣品。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標本運送應采用0℃冰壺。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區）
1.1 樣本前處理
固體樣本：用粉碎機或冷凍研磨儀將樣品研磨至細粉狀。
1.2 DNA提取
對于固體標本，DNA的提取可以采用SN/T 2584-2010中推薦的方法：
1) 每個樣品取2個平行管。稱取200mg粉碎的樣品，加入1mL預冷至4℃的抽提液，劇烈搖動混勻后，在冰上靜止5min，4℃條件下10000g離心15min，棄上清液；
2) 加入600uL預熱至65℃的裂解液，充分重懸沉淀，在65℃恒溫保持40min，期間顛倒混勻5次；
3) 室溫條件下10000g離心10min，取上清液轉移至新離心管中，加入5uLRNAseA，37℃恒溫30min，分別用等體積苯/酚：異戊醇溶液和三氯jia烷：異戊醇溶液各抽提一次；
4) 室溫條件下，10000g離心10min，取上清液至新離心管，加入三分之二體積的異丙醇，十分之一體積的3mol/L的乙酸鈉溶液（pH=6.5），-20℃放置2-3h；
5) 在4℃條件下，10000g離心15min，棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀；
6) 加入50uL TE（pH8.0）溶解沉淀，所得溶解即為樣品DNA溶液。
也可使用等效的DNA/提取試劑盒。
油脂樣本請直接選用市售油脂DNA/提取試劑盒，按說明操作
2. 試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 | CryAc反應液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
3. 加樣（樣本處理區）
將步驟1提取的DNA、陽性質控品、陰性質控品各取4μL，加入相應的
反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR擴增（核酸擴增區）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25ul；熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
4.3推薦循環參數設置：
步驟 | 循環數 | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結果分析判定
5.1 結果分析條件設定
設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節)、stop值(一般可在5~20范圍內調節)，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2 結果判斷
陽性：檢測通道Ct值≤35，且曲線有明顯的指數增長曲線；
可疑：檢測通道35<Ct值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為35<Ct值≤38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測結果Ct值>38或無Ct值。
6. 檢測方法的局限性
? 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
? 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；
? 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7. 質控標準
陰性質控品：Ct>38或無Ct值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且Ct值≤32；
以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
【注意事項】
? 所有操作嚴格按照說明書進行；
? 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，wan全混勻并短暫離心；
? 反應液應避光保存；
? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
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