豬血凝性腦脊髓炎病毒探針法RT-PCR試劑盒

產品名稱：豬血凝性腦脊髓炎病毒探針法RT-PCR試劑盒

英文名稱：Porcine Hemagglultinating Encephalomyelitis Virus(PHEV) Probe qRT-PCR Kit

豬血凝性腦脊髓炎病毒(Porcine Hemagglultinating Encephalomyelitis Virus,PHEV)是一種 RNA 病毒，會引起血凝性腦脊髓炎，是豬的一種急性傳染病，發生于出生后 4-7 天的仔豬，體溫短暫升高，先是食欲廢絕，隨后出現嗜睡、嘔吐、便秘。病豬背毛倒立、四肢藍色，有部分病豬打噴嚏、咳嗽、磨牙。1-3 天后出現中樞神經癥狀、步態不穩、趴地、發抖或痙攣、后肢逐漸麻痹。感覺過敏，遇突然聲響或擾動便發出嚎叫，最后病豬側臥，四肢做游泳動作，呼吸困難，  眼失明，眼球震顫、昏迷死亡，因此豬血凝性腦脊髓炎病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。本產品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術為基礎開發的專門檢測的試劑盒,它具有下列特點:

1.    即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2.    引物和探針經過優化，分析靈敏性高。

3.    提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4.    特異性高，引物是根據豬血凝性腦脊髓炎病毒高度保守區設計，不會跟其他  病毒的 RNA 發生交叉反應。

5.    既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5 個數量級。

6.    本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。

7.    本產品只能用于科研。

【試劑組成】

【自備試劑】樣品 RNA，超純水。

【樣本要求】

1. 新鮮采集的咽/拭子、鼻/拭子標本，并使用滅菌生理鹽水懸浮。

2. 患病動物的腦、心、肝、脾、肺、腎、扁桃體等病理組織。

3. 標本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-20℃～-80℃。

4. 標本保存期間應避免反復凍融。

【注意事項】

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能

污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本  產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。1. 標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.    用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。

3.    在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.    換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.    換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.    重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7.    如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的是 PC（樣品制備陽性對照）和 NC（樣品制備陰性對照）。可以取陽性對照的 1000 倍稀釋液10μL 再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規定體積一致，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8.    用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qRT-PCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9.    如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 RT-PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照（用水做模板）， 6 個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個RT-PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 RT-PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.    在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設  置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好  后最后加）：

11.  蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 RT-PCR：

五、數據處理

12.  如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13.  如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 36。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 36 則為陽性。如果在 36-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct

值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。