病毒性神經壞死病病毒染料法RT-PCR試劑盒

商品名稱：病毒性神經壞死病病毒染料法RT-PCR試劑盒

Name     ：Viral Nervous Necrosis Virus(VNNV) SYBR qRT-PCR Kit

病毒性神經壞死病病毒(Viral Nervous Necrosis Virus，VNNV)是一種RNA病毒，會引起病毒性神經壞死病，流行于除美洲和非洲外幾乎世界所有地區的海水魚類，對仔魚和幼魚危害很大，嚴重者在一周內死亡率可達100%，且近年受感染的魚類種類和受危害程度迅速增加，帶來重大經濟損失，因此快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。本產品基于PCR原理開發。它具有下列特點：

1. 一站式，用于不需要單獨準備每種成分，包括引物和對照。

2. 根據病毒性神經壞死病病毒的保守基因序列設計的引物，具有良好的特異性。

3. 基于染料法qRT-PCR檢測，靈敏度比常規RT-PCR高10-100倍，可以達到至少1000拷貝/反應。

4. 使用一管式qRT-PCR技術，RT和PCR兩步在一個試管內完成，不需要中間轉移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。

5. 本產品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

【試劑組成】

【儲存條件及有效期】

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供RNA片段作為陽性對照。

【自備試劑】樣品RNA

【使用方法】

一、稀釋陽性對照（以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原。

1.       標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

2.      在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

3.      換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

4.      換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品RNA的制備

5.       如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號（濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。

6.      用自選方法純化N+2個樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒RNA提取試劑盒兼容。

三、設置RT-PCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）

如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，

7.       1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個標曲反應縮減成1個，其余不變。

8.      在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加）：

注:需使用ROX染料I的機型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。需使用ROX染料II的機型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用ROX的機型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

9.       上機后按下面參數進行RT-PCR（參數可能會因儀器不同而需優化）。

四、數據處理

10.       如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。

       11.     如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。