立克次氏體通用探針法熒光定量PCR試劑盒

商品名稱：立克次氏體通用探針法熒光定量PCR試劑盒

Name     ：Rickettsia spp. Probe qPCR Kit

立克次氏體（Rickettsia）為革蘭氏陰性菌，是一類專性寄生于真核細胞內的 G原核生物。是介于細菌與病毒之間，而接近于細菌的一類原核生物。一般呈球狀或桿狀,是專性細胞內寄生物，主要寄生于節肢動物，有的會通過蚤、虱、蜱、螨傳入人體、如斑疹傷寒、戰壕熱。本產品就是以探針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發的專門檢測立克次氏體的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據立克次氏體通用高度保守區設計。

5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

6. 本產品只能用于科研。

【試劑組成】

【儲存條件及有效期】

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

【自備試劑】樣品 DNA。

【使用方法】

一、稀釋PCR 陽性對照（以10E1-10E6 拷貝/μL 這6個10倍稀釋度為例）

如果做定性實驗，則此步可以跳過。如果做定量實驗，則需要稀釋陽性對照做標準曲線。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。本產品只提供 DNA 片段作為陽性對照。

1.  標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.         用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。

3.         在 6 號管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照（試劑盒提供），充分震蕩 1 分鐘， 得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.         換槍頭，在 5 號管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.         換槍頭，在 4 號管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照（上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.         重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上用。

二、樣品 DNA 的制備

7.         如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是樣品制備 PC（樣品制備陽性對照），一個是樣品制備 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為樣品制備 PC。另外用水作為樣品制備 NC。

8.         用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA/提取試劑盒兼容。

二、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9.         如果做定量分析并且只做1次重復，則標記 N+9個PCR 管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于 PCR 陽性對照（用第4號管中的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為描述操作步驟，

在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設 置陽性對照，并且陽性對照樣

10.         品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

四、數據處理

12.         如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

     13.    如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 35。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。